■ カウンターディフュージョン法
■ カウンターディフュージョン法の原理
カウンターディフュージョン法とはキャピラリー中の蛋白質試料と、結晶化試薬を相互に拡散させる結晶化方法です。タンパク質分子はキャピラリーの中から外に、結晶化試薬分子はキャピラリーの外から中に拡散することにより、キャピラリー内で濃度勾配を形成します。キャピラリー内には経時的に広範囲の濃度条件が実現し、結晶生成条件に到達したところから結晶生成が始まります。このため、外液の結晶化試薬濃度を高めに設定することで、容易に広範囲の結晶生成条件を探索できます。つまり、クリスタルチューブキットでは、１本のキャピラリーの中で無限の結晶化条件をスクリーニングしてることになります。
1) McPherson A., Crystallization of Biological Macromolecules, Cold Spring Harbor Lab. Press (1999) 2) Garcia-Ruiz, J.M., Moreno, A.: Acta Cryst., D50, 484-490(1994)
■ 結晶化条件の準備
| 1 | 目的とするタンパク質のPIから1～2程度離れたpHのバッファを選択します。 |
| 2 | 以下の結晶化溶液を準備します。 ・Buffer + 4M (NH4)2SO4 ・Buffer + 30 % PEG 4000 + 100 mM ～ 1 M NaCl |
| 3 | ゲルチューブは10mmに切り、下記の溶液にあらかじめ数日～1週間程浸漬下さい。 |
| 4 | クリスタルチューブキットに蛋白溶液、結晶化溶液をセットします。内径0.3mm長さ50mmのｷｬﾋﾟﾗﾘｰに必要な蛋白溶液は2μlですので、僅か20μlのタンパク質溶液で最初の検討が可能です。 |
■ 結晶化の例
右表(C: 結晶生成、O: オイル、 P: 沈殿)に示すように、PEGを結晶化試薬として使用する場合には、最適な塩濃度があります。塩濃度が低すぎると溶液はクリアなままです。一方高すぎると沈殿やオイルになりやすくなります。 Reference ICCBM12 (2008) Program & Abstracts Book 128- 予めタンパク質試料とリザーバ溶液を1:1で混ぜてキャピラリーに充填することで、結晶化が加速することがあります。